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    新一代高精度單堿基基因編輯工具問世

    作者:來源:發布時間:2020-05-18

      CRISPR/Cas9的衍生工具DNA單堿基編輯技術可以在不切斷DNA雙鏈的情況下實現單核苷酸的定向突變,為單堿基突變引起的遺傳性疾病的治療帶來了希望,自2016年首次報道以來受到了廣泛的關注。2019年,單堿基編輯工具的安全性受到了質疑,先是楊輝等研究組報道了胞嘧啶單堿基編輯器存在嚴重的DNA脫靶,接著Keith Joung團隊、David Liu團隊和楊輝團隊又分別報道了胞嘧啶單堿基編輯器和腺嘌呤單堿基編輯器存在大量的RNA脫靶效應。雖然先前的研究中通過引入突變的方式顯著降低了RNA的脫靶,但是胞嘧啶單堿基編輯器的DNA脫靶依然沒有得到解決。     

      518日,《Nature Methods》期刊在線發表了題為《A rationally engineered cytosine base editor retains high on-target activity while reducing both DNA and RNA off-target effects》的研究論文,該研究由中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心(神經科學研究所)楊輝研究組、中國科學院上海營養與健康研究所隸屬的計算生物學研究所(中國科學院-馬普學會計算生物學研究所)李亦學研究組和中國農業科學院深圳農業基因組研究所左二偉研究組合作完成。該研究根據蛋白結構預測了脫氨酶ssDNA結合的重要氨基酸,在不影響催化活性的情況下,突變相應的氨基酸(APOBEC1上的ssDNA結構域相應氨基酸),從而得到了顯著降低DNA脫靶的CBE突變體。     

      CBE的脫靶是由脫氨酶產生的。脫氨酶利用自身的ssDNARNA結合能力,攜帶Cas9蛋白在基因組或者轉錄組中隨機與ssDNARNA結合,并且利用自身催化活性將C突變為T,從而造成單堿基基因編輯工具基因組和轉錄組范圍內完全隨機無法預測的脫靶效應。對此,研究者通過兩種方式試圖降低CBE的脫靶,第一種是在CBE的脫氨酶APOBEC1上引入突變,以此消除ssDNARNA的結合能力。他們一共構建了23CBE突變體,其中 4個突變體不影響基因編輯效率檢測,而后通過DNARNA的脫靶檢測后獲得的3個突變體BE3R126E、BE3R132EYE1-BE3能夠顯著降低DNARNA的脫靶SNV。該方法是通過突變APOBEC1上的核酸結合域關鍵位點,改變蛋白構象,破壞結合能力,降低隨機脫靶。另外一種方式是利用來自于人的APOBEC3A蛋白替換APOBEC1蛋白,并在APOBEC3AssDNA結合位點引入突變,但是這種方式只能降低RNA的脫靶,而不能降低DNA上的脫靶。因此,本研究以YE1-BE3為研究重點。為進一步提高YE1-BE3編輯效率,研究者隨后又在突變體基礎上增加標簽和核定位序列(FNLS)。優化后的單堿基編輯工具YE1-BE3-FNLS在保證高保真的情況下,顯著提高了基因編輯效率,從而成為既安全又高效的新型基因編輯工具。 

        

      該研究結果和David Liu團隊今年210日發表在《Nature Biotechnology》的研究結論一致,兩篇文章都報道YE1在保持較高的編輯效率的同時降低了DNARNA上的脫靶,同時縮小了編輯窗口,并降低了indel產生的比例。但是David Liu團隊基于細菌抗性篩選的方法只適用于CBE,而楊輝團隊基于GOTI的方法是不受限制的,不僅可以檢測單堿基編輯器,還可以用于其它基于融合蛋白的基因編輯工具的安全性檢測和改進。在本研究中楊輝團隊使用GOTIRNA-Seq同時檢測了突變體的DNA脫靶和RNA脫靶,并且發現DNARNA的脫靶是互相獨立的,需要同時檢測。他們獲得的 YE1-BE3-FNLS是高精度、高活性單堿基編輯工具,顯著降低了脫靶效應,提高了編輯效率,有望應用于遺傳疾病基因治療,推動基因編輯臨床化應用。    

      中國農業科學院深圳農業基因組研究所左二偉研究員,中科院分子細胞卓越創新中心孫怡迪博士,中國農業科學院深圳農業基因組研究所助理研究員袁堂龍,中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心賀冰冰和周昌陽博士為論文共同第一作者,楊輝研究員、李亦學研究員和左二偉研究員為共同通訊作者。 

        

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